Shanet Susan Alex

Résistance paxlovid associée aux mutations SARS-CoV-2 3CLpro

Dans une étude récente publiée dans le bioRxiv*serveur de préimpression, des chercheurs de l’Université de médecine d’Innsbruck ont ​​évalué les mutations 3CLpro du coronavirus 2 (SARS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère responsables de la résistance au Paxlovid. La 3-chymotrypsine-like protease (3CLPro), ou protéase majeure (Mpro), est la principale protéase retrouvée dans les coronavirus.

Étude : Les mutations SARS-CoV-2 3CLpro confèrent une résistance au Paxlovid (nirmatrelvir/ritonavir) dans un système sans gain de fonction basé sur le VSV.

Étude : Les mutations SARS-CoV-2 3CLpro confèrent une résistance au Paxlovid (Nirmatrelvir/ritonavir) dans un système sans gain de fonction basé sur le VSV.

Arrière plan

Les inhibiteurs de protéase sont l’un des agents antiviraux les plus puissants. La Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis a récemment approuvé l’utilisation de Paxlovid (ritonavir/nirmatrelvir), le premier inhibiteur de protéase contre la principale protéase du SRAS-CoV-2, en tant que 3CLpro et protéine non structurelle 5 (Nsp5).

Le virus de l’hépatite de la souris (MHV) 3CLpro a été utilisé comme substitut du SARS-CoV-2 3CLpro pour collecter des informations sur la résistance dans les enquêtes qui ont conduit à l’autorisation d’utilisation d’urgence (EUA) de Paxlovid. Le 3CLpro du MHV et du SARS-CoV-2 montre une similarité de séquence de 50 %. En particulier, il n’existe actuellement aucune preuve publiée sur la résistance au SRAS-CoV-2.

Étonnamment, les nouvelles variantes du SRAS-CoV-2 ont surpassé les vaccins actuels contre la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Il existe donc une menace similaire pour les futurs médicaments antiviraux pour COVID-19.

À propos de l’étude

La présente étude a comparé le SARS-CoV-2 3CLpro et un panel d’autres protéases virales couvrant le MHV 3CLpro dans une expérience de gain de signal récemment établie pour établir des mutants SARS-CoV-2 3CLpro résistants au Paxlovid.

L’équipe a créé une variante chimérique du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV), remplaçant le domaine intergénique entre la polymérase (L) et la glycoprotéine (G) par le SARS-CoV-2 3CLpro. Il s’agissait d’établir un substitut sûr aux enquêtes sur le gain de fonction.

Pour l’analyse initiale de preuve de concept, les chercheurs ont sélectionné un mutant ciblant l’inhibiteur GC376, qui héberge une variation d’acides aminés de la phénylalanine à la leucine en position 305 (F305L) dans 3CLpro. De plus, le mutant F305L a été utilisé dans d’autres investigations de dépistage de mutations pour tester la possibilité d’accumulation de mutations multiples dans 3CLpro.

Séquençage des mutants d'échappement et comparaison avec Pfizer EUA et bases de données de séquences.  a : les mutants ont été récupérés à partir de VSV-G-3CLpro-L de type sauvage

et variante F305L prémutée (rouge **). Les mutants du site d’autoclivage sont colorés en turquoise, les mutants du site catalytique en vert, les mutants proches du site catalytique en vert clair et les mutants « allostériques » en blanc. Les virus avec plus d’une mutation sont présentés séparément et sont répertoriés af. Les fréquences des bases de données de séquences sont indiquées sous les mutations en gris. Les mutations de Pfizer USA sont divisées en mutations trouvées dans la culture cellulaire et séquencées à partir de patients traités. Des mutations supplémentaires du site de clivage distant en dehors du cadre de lecture ouvert 3CLpro sont représentées en bas. La couverture en entrée des mutations a été obtenue le 3 mars 2022. b : Visualisation des résidus affectés par les mutations. Les résidus qui ont subi une mutation sont surlignés en jaune, deux fois en orange clair, trois fois en orange foncé et quatre fois en rouge. Le dimère de protéase 3CLpro avec le nirmatrelvir lié a été visualisé dans ChimeraX à partir de la structure 7vh8 de la Protein Data Bank. Les mutations du noyau catalytique se situent dans une plage de 5 ångström, comme visualisé en vert foncé.

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De plus, les auteurs ont déterminé le 3CLpro résistant au nirmatrelvir en utilisant les souches de type sauvage et mutantes du SRAS-CoV-2 F305L. Par la suite, ils ont examiné les régions 3CLpro et G et L voisines dans les virus sélectionnés.

Les scientifiques ont classé les mutations trouvées le long de la séquence 3CLpro en mutants d’autoclivage et de site catalytique. Les mutants allostériques ont été sélectionnés comme troisième catégorie pour toute mutation non incluse dans les deux premières. Ils ont recherché ces mutants particuliers dans l’EPICOV de l’Initiative mondiale pour partager toutes les données sur la grippe (GISAID) et la base de données virale du Centre national d’information sur la biotechnologie (NCBI).

Les déclarations du GISAID faites avant et après l’EUA Paxlovid le 22 décembre 2022 ont été séparées en deux groupes. Les chercheurs ont sélectionné six échantillons de virus pour effectuer des études de dose-réponse et de cinétique de réplication par rapport à leur variante virale ancestrale afin de valider les mutations de résistance putatives révélées. Ils ont choisi des virus pour des évaluations plus poussées axées sur deux critères. Dans un premier temps, les auteurs ont sélectionné des souches virales présentant des altérations du site catalytique. Deuxièmement, ils incluaient le mutant le plus fréquent en dehors du noyau catalytique.

L’équipe a réintroduit certaines mutations catalytiques du noyau dans un outil d’évaluation de la fonction de la protéase récemment mis en place, basé sur un VSV incompétent pour la réplication. Il s’agissait de corroborer les résultats de la résistance au VSV-G3CLpro-L compétent pour la réplication et, en même temps, d’exclure la possibilité que de nouvelles mutations se développent au cours du test dose-réponse. La méthode de lecture est passée d’un FluoroSpot à un tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour augmenter la sensibilité du test.

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Résultats et conclusions

Les résultats de l’étude ont démontré que dans le test de gain de signal récemment mis en place, le MHV 3CLpro ne répond que modestement au nirmaterlvir. Bien que les structures du MHV et du SARS-CoV-2 3CLpro aient été conservées de manière significative, les scientifiques ont émis l’hypothèse qu’une faible identité de séquence d’acides aminés modifie de manière significative l’affinité de la poche de liaison envers le nirmatrelvir pour produire une certaine résistance contre l’inhibiteur. . Dans les 5 ngström ou moins, les principaux résidus correspondants de la poche de liaison : M165-L, H164-Q, P168-S, R188-A, V186-R, A191-V et T190-V, étaient différents.

De plus, la séquence MHV 3CLpro présente déjà les altérations d’acides aminés F305L et Y126F observées dans l’expérience d’induction de mutation. Par conséquent, les chercheurs affirment que MHV 3CLpro n’était pas le meilleur substitut pour les tests de résistance 3CLpro.

Le mutant F305L a été trouvé dans un petit test de preuve de concept utilisant l’inhibiteur GC376 et a montré une résistance au GC376 et au nirmatrelvir et une cinétique de réplication légèrement rapide. L’ajustement de la région d’autoclivage C-terminal de FQ (P2/P1) vers LQ (P2/P1), qui était un motif de reconnaissance privilégié, peut expliquer ces caractéristiques.

Les mutations du SARS-CoV-2 F305L et les souches de type sauvage ont été détectées en utilisant la pression de sélection pour le nirmatrelvir, ce qui a permis aux mutants d’échapper à l’inhibiteur. Le phénotype de résistance de ces mutations a été confirmé en effectuant des tests dose-réponse et en réintroduisant des mutations dans des systèmes de surveillance de l’activité des protéases récemment établis.

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Les mutants répondent différemment aux composés inhibiteurs en raison de leur différence structurelle, comme le démontre l’équipe en utilisant les exemples nirmatrelvir et GC376. Les découvertes actuelles pourraient aider à l’adaptation de la structure composite dirigée à l’avenir.

Collectivement, les mutations SARS-CoV-2 3CLpro responsables de la résistance à l’inhibiteur de la protéase nirmatrelvir, telles que G138S, Y54C, L167F, A194S, Q192R et F305L, ont été découvertes dans la présente enquête. Ces résultats justifient l’utilisation prudente des inhibiteurs de la protéase chez les patients à haut risque, car une utilisation non sélective extensive pourrait rapidement entraîner une résistance aux médicaments. *Nouvelles importantes

bioRxiv
  • publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et ne doivent donc pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou être traités comme des informations établies.

Référence du journal : Les mutations SARS-CoV-2 3CLpro confèrent une résistance au Paxlovid (Nirmatrelvir/ritonavir) dans un système sans gain de fonction basé sur le VSV ; Emmanuel Heilmann, Francesco Costacurta, André Volland, Dorothée von Laer. bioRxiv Preprint 2022, DOI :

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