Les chercheurs découvrent la protéase hôte CAPN2 en tant que nouveau facteur hôte facilitant l’infection par le SRAS-CoV-2

Dans une étude récente publiée dans le bioRxiv*preprint server, les chercheurs ont étudié le potentiel de la molécule calpaïne-2 (CAPN2) en tant que cible thérapeutique contre le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2).

Antécédents

La maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) a causé une morbidité et une mortalité considérables dans le monde, justifiant le développement d’agents thérapeutiques contre le SRAS-CoV-2. Les auteurs de la présente étude ont précédemment découvert que les molécules inhibitrices de la calpaïne inhibaient efficacement le SRAS-CoV-2 en ciblant le M^Pro (protéase principale) enzyme du virus, essentielle au traitement des protéines du SRAS-CoV-2.

À propos de l’étude

Dans la présente étude, les chercheurs ont développé leur analyse précédente en étudiant le capplain-2 comme cible probable pour développer des agents anti-SARS-CoV-2.

Les auteurs avaient récemment examiné des composés antiviraux utilisant des cellules Vero E6 et le virus recombinant SARS-CoV-2mNeonGreen, dans lesquels plusieurs composés ont démontré une efficacité anti-SARS-CoV-2, et les 18 principaux résultats ont été validés dans la présente étude. Pour les expériences de validation, des virus rapporteurs de la protéine fluorescente e-verte (eGFP) du virus de la stomatite vésiculeuse recombinante (VSV) codant pour la protéine de pointe (S) native du VSV-G ou du SARS-CoV-2 ont été utilisés. .

Pour déterminer si le composé MG132 qui ciblait l’hôte CPN2 pouvait inhiber le SRAS-CoV-2, des molécules inhibitrices de calpaïne telles que l’ALLN, la calpeptine, l’E-64d et l’inhibiteur de calpaïne III ont été utilisées, car les molécules inhibent la calpaïne avec des spécificités variables et ciblent la calpaïne famille. différemment.

Pour évaluer l’implication de CAPN2 dans le COVID-19, un knock-out génétique (KO) du gène à l’aide de Cas9/CRISPR facilité par un lentivirus (répétition de palindromes courts régulièrement espacés en cluster) a été réalisé parmi les cellules MA104, qui expriment l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2 ), critique pour l’entrée virale.

De plus, une analyse Western blot a été effectuée pour valider l’efficacité de CAPN2 KO. Les cellules CAPN2 KO et de type sauvage (WT) ont été inoculées avec la protéine S du SARS-CoV-2 exprimant le VSV chimère (VSV-SARS-CoV-2).

Des analyses de plaque standard des infections par le VSV-SARS-CoV-2 ont été effectuées et le moment auquel CAPN2 a exercé des effets proviraux a été déterminé. Les cellules KO et WT ont été inoculées avec VSV-SARS-CoV-2, et le niveau d’acide ribonucléique messager viral (ARNm) a été déterminé entre 1,0 et 6,9 heures après l’infection (hpi) par réaction en chaîne de la polymérase de transcription inverse quantitative (RT-qPCR ).

De plus, une souche SARS-CoV-2 recombinante avec les mutations S, D614G, E484K et N501Y a été testée. Des cellules CAPN2 KO MA104 d’un seul clone ont été générées et confirmées par séquençage Sanger. De plus, des tests classiques de liaison à froid du VSV-SARS-CoV-2 ont été effectués pour déterminer si l’adsorption du VSV-SARS-CoV-2 était affectée négativement par le manque de capellan-2 et le possible clivage du VSV-SARS-CoV-2 a été évaluée la protéine S par CAPN2.

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Des expériences de cotransfection ont été réalisées à l’aide de cellules 293 de rein embryonnaire humain (HEK) exprimant l’ACE2 et la protéine S de la souche WA1, avec CAPN2, furine ou TMPRSS2 (transmembrane sérine protéase 2), des protéases clés signalées pour cliver la protéine S pour une invasion efficace de l’hôte. Par la suite, l’équipe a collecté des lysats cellulaires et quantifié les intensités de la protéine S complète et du produit clivé, sous-unité 2 (S2), suivie d’une évaluation des niveaux d’ACE2 dans les cellules CAPN2 KO et WT.

Résultats

Les inhibiteurs de la calpaïne (inhibiteur de la calpaïne III, calpeptine, E-64d et ALLN) ont inhibé efficacement le VSV-SARS-CoV-2 avec une concentration d’inhibition efficace de 50 % (EC_cinquante) des valeurs <1,5 µM, mais pas Mpro et, à l'inverse, les inhibiteurs de la calpaïne n'ont pas montré d'activité antivirale contre les protéines WT VSV natives. Les infections à VSV-SARS-CoV-2 ont été considérablement réduites parmi les cellules KO calpain-2, et CAPN2 était essentiel pour une première étape de la prolifération du SARS-CoV-2. CAPN2 a promu la liaison du SRAS-CoV-2 aux cellules hôtes.

Les résultats ont indiqué que les molécules inhibitrices de la calpaïne ciblaient une voie Mpro-indépendante pour inhiber efficacement le SRAS-CoV-2 et la calpaïne-2 en tant que nouveau facteur hôte qui pourrait potentiellement être ciblé sur l’étape d’invasion de la cellule hôte de la calpaïne pour élargir le paysage thérapeutique de la COVID-19. . La plupart des composés antiviraux testés ont démontré une infection dose-dépendante par inhibition du VSV et du VSV-SARS-CoV-2 parmi les cellules MA104.

IMBX (3-isobutyl-1-méthylxanthine), nigéricine et brefeldine A ont montré CD_cinquante valeurs inférieures à 2,0 μM contre les infections VSV et VSV-SARS-CoV-2. Le nitazoxanide a montré une inhibition du SRAS-CoV-2 et le MG132 était 100 fois plus sélectif en activité contre le VSV et le VSV-SARS-CoV-2 avec CD_cinquante valeurs de 44 et 0,6 µM, respectivement. Aucun inhibiteur, à l’exception de la calpeptine, n’a montré de cytotoxicité. L’ARNm du VSV-SARS-CoV-2 a été réduit de 4,0 fois dans les cellules dépourvues de CAPN2. Les plaques VSV-SARS-CoV-2 mesuraient respectivement 1,0 mm et 2,0 mm sur les cellules KO et WT. Cependant, il n’y avait pas de différences significatives dans la taille des plaques VSV dans les cellules KO et WT.

Les signaux VSV-SARS-CoV-2 GFP ont été réduits parmi les cellules knock-out CAPN2 à six hpi, indiquant que CAPN2 a aidé la réplication du SARS-CoV-2. Des niveaux significativement plus faibles de protéine S et d’ARNm de VSV-SARS-CoV-2 ont été observés dans les cellules KO par rapport aux cellules WT. Fait intéressant, des niveaux d’ARNm non significativement inférieurs ont été trouvés dans les cellules knock-out CAPN2, indiquant que les effets de CAPN2 sur le SRAS-CoV-2 dépendaient probablement de la nature de la protéine S.

De plus, les niveaux d’ARNm viral dans les cellules KO et WT étaient similaires en présence d’incubation d’anticorps. L’analyse de colocalisation WGA (agglutinine de germe de blé) et ACE2 a démontré des niveaux significativement inférieurs d’ACE2 à la surface parmi les cellules CAPN2 193 KO.

conclusion

Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont montré que la calpaïne-2 régulait positivement la présence d’ACE2 sur les surfaces cellulaires, améliorant ainsi la liaison à médiation S et l’infectivité du SRAS-CoV-2. Par conséquent, CAPN2 pourrait être considéré comme un nouveau facteur proviral qui facilite l’entrée dans la cellule hôte du SRAS-CoV-2.

*Nouvelles importantes

bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et ne doivent donc pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique ou les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.